摘要：cDNA-AFLP技术广泛应用于基因表达研究的各个方面，但是此方法需要大量的总RNA。本文以棉纤维为材料对cDNA-AFLP技术进行了改良。传统的技术中mRNA从总RNA提取出时要从磁珠上洗脱及纯化，之后的反转录、双链cDNA合成、酶切都要纯化模板；而改良后的技术是从提取mRNA到酶切都是在磁珠上进行的。结果得出：优化后的技术使总RNA用量从原来的500μg减少到50μg；相应试剂的用量也减少到原来的1/6-1/5；同时简化了操作流程；并且结果显示良好，提高了实验效率。
关键词：cDNA-AFLP，总RNA，棉花
中图分类号：S562
cDNA-AFLP是Bachem等[1]在基因组DNA的选择性扩增限制性片段多态性即AFLP (Amplified fragment length polymorphism)的基础上发展出来的一种RNA指纹分析的技术，广泛应用于基因表达差异的分析、基因克隆以及转录组遗传连锁作图等[2]。
前人曾用此方法分析了棉花的纤维[3][4]、叶[5]、种子[6]、下胚轴[7]、花药[8][9]等组织发育过程中相关基因的表达情况。但由于此技术的传统方法需要提取大量RNA,而一些组织比如花药或者某些成熟的组织中总RNA含量较少，提取大量RNA就相对困难[10]。为使cDNA-AFLP能够研究稀有材料并且操作简便，本文参照Bachem等（1998）[10]的建议对传统cDNA-AFLP的操作流程进行了改良。
1.材料与方法：
1.1 材料
1）9个品种（表1）（四个纤维高强品种、一个早熟品种中棉所36、四个高强与对照组配的杂交一代品种）于2005年5月1日种于中国农业大学科学园区，按常规方法管理。摘取各品种12DPA的棉铃，用灭菌后的解剖刀剖开棉铃，取出籽棉速冻于液氮中，-80℃保存。
表1 实验材料
高强品种
对照品种
杂交一代
2001 (G1)
7235 (G2)
贝尔斯诺 (G3)
Acala1517-77 (G4)
中棉所36 (G7)
G1×7
G2×7
G3×7
G4×7
2）cDNA-AFLP引物和接头序列如下：
TaqI 接头: 5’-GACGATGAGTCCTGAC-3’
3’-TACTCAGGACTGGC-5’
1本课题组得到国家高技术研究发展计划（项目编号：2006AA10A108）资助。 - 1 -
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AselI 接头: 5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’
3’-CTGACGCATGGAT-5’
TaqI预扩增引物: 5’-GATGAGTCCTGACCGA-3’
TaqI选择性扩增引物: 5’-GATGAGTCCTGACCGANN -3’(N 代表A、T、G、C 中一种)
AselI预扩增引物: 5’- GACTGCGTACCTAAT-3’
AselI选择性扩增引物: 5’- GACTGCGTACCTAATNN-3’
均由上海英骏生物技术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 纤维总RNA的提取
采用CTAB-PVP法，具体操作按照刘洋等（2006）[11]中的方法。
1.2.2 cDNA-AFLP方案Ⅰ
参照Bachem等（1996）[1]所述方法进行。
1）mRNA纯化：按照Promega 公司试剂盒PolyATtract(R) mRNA Isolation systemⅣ的方法。
2）反转录及cDNA 合成：根据Promega 公司Universal Riboclone(R) cDNA Synthesis system试剂盒的方法。
3）之后的步骤参照Vos等（1995）[12]的方法。
1.2.3 cDNA-AFLP方案Ⅱ
参照Bachem等（1998）[10]的建议对cDNA-AFLP方案Ⅰ进行了如下改进：
1）mRNA纯化：操作基本按照方案Ⅰ进行，只是磁珠用量由原来的600μL减少到100μL，Biotin-Oligo d（T）用量由原来的3μL减少到0.6μL。操作完成后不进行洗脱直接进行反转录。
2）反转录及cDNA合成：用M-MLV buffer 20μL重悬磁珠，磁力架上收集磁珠，吸弃buffer。反转录：在磁珠管中加入M-MLV buffer(10×)5μL，重蒸水13μL，dNTP（2.5μM each）4μL，RNA 酶抑制剂（40U.μL-1 购于Promega公司）1μL，M-MLV RT（200U.μL-1购于Promega公司）2μL，混匀后42℃水浴1小时，75℃10分钟后加入第二链合成体系。DNA polymerase I buffer(10×) 4μL，RNase H（20~60U.μL-1 购于Takara公司 ）1μL, dNTP（2.5μM each）4μL，DNA PolymeraseI（3~6U.μL-1 购于Takara公司）10U，重蒸水补足至40μL。15℃反应2小时。转至70 10℃分钟。加入1U 的T4 DNA Polymerase，3710℃分钟。不进行cDNA纯化直接进行酶切。
3）酶切：磁力架上收集吸附有双链cDNA的磁珠，吸弃上清，在管中加入限制性内切酶的缓冲液50μL重悬磁珠一次，磁力架上收集磁珠吸弃上清，随后各反应步骤均如cDNA-AFLP方案Ⅰ。
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2.结果与分析
2.1起始总RNA用量的比较
实验表明，方案Ⅰ的总RNA起始用量为500μg，才可以在1.5%的琼脂糖胶上明显检测到预扩增产物（图1A）；而方案Ⅱ只需50μg即可检测到预扩增产物（图1B）。可见方案Ⅱ比方案Ⅰ总RNA起始用量大大减少，减少了一个数量级。同时相应试剂的用量也减少到原来的1/6-1/5，节省了实验成本。
2.2 两方案的预扩增比较
方案Ⅱ的预扩增片断（图1B）大小大致分布在100bp至600bp之间，主要集中于300bp附近。各材料酶切程度均一，说明每个材料的酶切比较完全；各泳道条带明亮度基本一致，说明起始RNA量一致的各材料cDNA酶切产物量也基本保持一致。方案Ⅰ的预扩增检测结果说明（图1A）虽然RNA起始用量完全一致，但从检测结果可以看出，泳道9亮度明显弱于其它,说明操作中各材料的损失程度不一；而且各材料之间酶切程度也不均一，泳道6的材料片段主要分布在200-2000bp之间，明显存在酶切不完全的情况，同时其它泳道酶切状况也不尽相同，比如泳道1材料的酶切片段分布在100-500bp之间，泳道9材料的酶切片段则分布在200-500bp之间。
图 1 (A): cDNA-AFLP方案Ⅰ预扩增产物检测. (B):cDNA-AFLP方案Ⅱ预扩增产物检测
泳道1至9顺序为2001 (G1), 7235 (G2), 贝尔斯诺(G3), Acala517-77 (G4),中棉所36(G7), G1×7 , G2×7, G3×7, G4×7. M1: Marker从下到上100bp、250bp、500bp、700bp、1000bp、2000bp
M2: Marker从下到上100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp
2.3 指纹图谱
方案Ⅱ对方案Ⅰ的操作改良后，方案Ⅱ的各材料表现出酶切程度均一且浓度也较一致；而方案Ⅰ各材料因酶切程度不均一而出现扩增片段大小差异悬殊并且浓度也不一致，导致各材料可比性不高。因此本文用方案Ⅱ的选择性扩增产物为模板进行6%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分析（图2）。实验结果表明，条带分辨率高、稳定性也好。从指纹图谱可以看出主带明显；差异分明，既能看出质的差异也能看出量的差异。从主带表现出浓度均一可以再次证明各品种酶切程度均一且量也较一致。在本课题组之后的研究中采用这种方案先后分析了208对引物的扩增结果，获得57个差异条带信息。说明方案Ⅱ技术是可行的。
3.讨论
鉴于成熟棉纤维以及一些稀有材料提取大量RNA比较困难，而传统的cDNA-AFLP技术
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需要大量RNA。Bachem等（1998）[10]以马铃薯为材料对传统cDNA-AFLP技术进行改良，从吸取mRNA，经过反转录、合成双链cDNA、酶切都是在磁珠上进行的。本文参考这种改良对棉花cDNA-AFLP技术进行相应的改良。改良后的技术只需要50μg总RNA，是传统用量的10％；整个操作流程的时间也从常规的三天减少到只需要24个小时就可以完成从mRNA纯化到选择性扩增产物的琼脂糖胶检测。
图2 9个不同棉花品种用引物组合（AselI+ AG, TaqI+AG）扩增的指纹图谱. 泳道1至9顺序为2001 (G1), 7235 (G2), 贝尔斯诺(G3), Acala517-77 (G4),中棉所36 (G7) , G1×7 , G2×7, G3×7, G4×7.
从预扩增产物检测结果看出方案Ⅰ（图1A）中材料之间酶切程度不均一，个别材料存在酶切不完全的情况；虽然各材料起始RNA用量严格一致，但预扩增产物各泳道亮度不一，各材料出现量的差异。原因是：（1）由于受到体系中残留杂质的影响进行酶切时有不完全的现象存在（图1A第6泳道）。（2）mRNA由总RNA提取出时从磁珠上洗脱，加之进行之后的反转录、双链cDNA合成以及酶切都要进行纯化模板，每次纯化都无可避免的损失模板量，造成每个材料的模板残余量不均一，因此材料之间的可比性下降。如果每个步骤都进行严格定量可以使最后模板量相同，可比性问题得以解决，但无形中又增加了操作步骤和延长了操作时间。方案Ⅱ的预扩增产物检测（图1B），材料之间酶切程度较均一，各泳道明暗一致。说明操作过程中丢失量的程度很低，说明起始材料量的一致可以保持到cDNA反转录、合成、酶切以及连接。原因是：方案Ⅱ中从提取mRNA到酶切都是在磁珠上进行的。这样可以减少最初模板残留DNA的干扰。合成反应结束后，连接了cDNA的磁珠被磁力架吸附，合成体系中的其他物质留在上清中，可以很方便地吸弃，只留下双链cDNA，相当于纯化了的cDNA，且比较方案Ⅰ中合成的cDNA，纯化得更干净；同时还避免了cDNA因为抽提和沉降而造成的损失。因为不受合成体系中残留杂质的影响，所以限制性内切酶切这样的cDNA时更彻底，效果更好。也是因为一直黏附在磁珠上，不会因为步骤的更替而损失，所以只要起始RNA量一致，最后得到的连接产物即预扩模板的浓度一定是大致相等的。另外关于酶切时，每条cDNA的3’ 端均黏附在磁珠上，所以模板中是缺少的3’端的，有研究证明这并不影响检测到想要的多态条带[10]。
标准的cDNA-AFLP体系中，采用识别序列分别为6bp和4bp的双酶切组合。分析cDNA时，内切酶的选择主要取决于切割的频率。理想的酶切组合是识别位点为6bp的酶在每个cDNA样品中有一个酶切位点，而在其一边或两边有一个4bp的酶切位点，酶切片段的大小在100-1000bp之间[1][10]。前人采用cDNA-AFLP技术研究棉花多采用利用EcoRI/MseI组合，在本实验中采用TaqI/AselI酶切片段经扩增后主要分布在100-500bp之间，并且经过6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后条带表现良好，说明这对酶切组合也是可用的。并且选择性扩增引物3’
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末端用2个选择性碱基，约256个引物组合基本能覆盖整个转录组[13]。
改良后的cDNA-AFLP技术可以成功用于分析稀有材料（需要少量总RNA），减少实验成本；并且简化了操作步骤，大大提高了实验效率。
参考文献
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代写论文
Improvement of cDNA-AFLP Technology in Cotton (Gossypium hirsutum L.)
He Yuqi, Wu Yongli, Hua Jinping, Yang Youming
Department of agriculture and biotechnology, China Agricultural University, Beijing, PRC, (100094)
Abstract
cDNA-AFLP technology is been applying various facts of gene expression extensivly, but this method needs plenty of total RNA. This report provides a detailed and updated protocol to improved conventional protocals of cDNA-AFLP in cotton (Gossypium hirsutum L.) . We have used a procedure where the mRNA remains attached to the magnetic beads during first and second strand cDNA synthesis. Finally, we used 50μg of total RNA instead of 500μg, cut corresponding reagents to 1/5-1/6 of original state, and the result sindicated that this procedure was well. The procedure of traditional cDNA-AFLP was simplified at the same time.
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