摘 要: 目的：动态观察复黄生肌愈创油膏对Wister大鼠糖尿病创面中TGF-β1、smad3、smad7
含量变化的影响。方法：36只雄性Wister大鼠随机分为正常对照组，糖尿病对照组，糖尿病
实验（复黄膏）组。采用免疫组化技术，观察不同时段创面中TGF-β1、smad3、smad7含量
变化。结果：3天时，糖尿病实验组TGF-β1含量明显高于糖尿病对照组（P<0.05），但和正
常对照组比较无统计学差异；糖尿病实验组smad3含量明显高于糖尿病对照组（P<0.05），但
和正常对照组比较无统计学差异；smad7含量三组比较无统计学差异。11天时，糖尿病实验
组TGF-β1含量明显低于正常对照组（P<0.05），但和糖尿病对照组比较无统计学差异；糖尿
病实验组smad3含量明显低于正常对照组（P<0.05），但和糖尿病对照组比较无统计学差异；
糖尿病实验组smad7含量明显高于正常对照组和糖尿病对照组（P<0.05）。结论：TGF-β1、
smad3在糖尿病实验组创面愈合早期表达上调，表明复黄生肌愈创油膏通过促进创面生长因
子的表达及其信号转导，从而起到促进创面愈合的作用；而在创面愈合晚期，TGF-β1、smad3
在糖尿病实验组表达下调，smad7作为细胞内Smad信号的抑制剂表达上调，可能为复黄生肌
愈创油膏促进了创面愈合的负反馈机制，及时中止成纤维细胞过度生长，防止瘢痕形成。
关键词: 复黄生肌愈创油膏；创面愈合；TGF-β1；smad3；smad7
中图分类号：R26
0. 引言
创面愈合是皮肤外科领域中一个重要问题，而糖尿病、截瘫、局部射线照射等所致的创
面临床愈合困难，因此探究创面修复与再生的机理,寻找有效地促进创面愈合的治疗方法,有
着十分重要的意义。复黄生肌愈创油膏，是唐汉钧教授根据长期治疗皮肤创面的经验所制,
为进一步探讨复黄生肌愈创油膏（简称复黄膏）的促进创面愈合机制,现通过大鼠糖尿病创
面模型外用复黄膏后创面中生长因子变化的动态研究,探讨其部分作用机理。
1. 材料与方法
1.1 实验动物及分组
清洁级Wister 大鼠，雄性，质量（220±20）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供（批
号医动字第scxk（沪）2003－0003 号）。将大鼠随机分为创面造模后换药3 天和11 天2 个
观测时段。每个时段又分为正常对照组、糖尿病对照组和糖尿病实验（复黄膏）组，共3
组，每组各6 只动物。
1.2 药物组成及制备
复黄生肌愈创油膏（复黄膏）：主要药物有: 紫草150g，血竭75g，大黄150g，龙骨75g,鸡
蛋黄500g，珍珠层粉150g，象皮300g，风化石灰水500ml，麻油1000ml。制作方法:先将
紫草、大黄、龙骨、象皮入麻油内浸3 日, 用慢火熬微枯, 细绢滤清, 放入煮熟蛋黄, 文火煎
熬, 去渣。入血竭化尽。加入珍珠层粉、风化石灰水, 搅调百遍, 备用。每毫升油膏含生药
四氧嘧啶（Alloxan），试剂编号：2244-11-3，瑞士FULKA 公司产品（由上海中医药大
学药理毒性实验室提供）。罗氏ACCU-CHEK ACTIVE 血糖仪和血糖测试试纸，编号：
2005-10, 22896931,瑞士Roche 公司产品。0.1%盐酸氯胺酮，试剂编号：KD061201，江苏恒
瑞医药股份有限公司产品。新洁尔灭酊、0.9%生理盐水（上海中医大学附属龙华医院提供）。
转化生长因子β-1 多克隆抗体，工作浓度1:100；Smad3 多克隆抗体，工作浓度1:100；Smad7
多克隆抗体，工作浓度1:100；Ⅰ型胶原多克隆抗体，工作浓度1:50；III 型胶原多克隆抗体，
工作浓度1:200；上述抗体均为美国Santa Cruz 公司产品。二抗抗体（生物素标记的抗鼠或
抗兔IgG），工作浓度1∶200；EnVision 试剂盒，工作浓度1∶100，均为丹麦Dako 公司产
品。3，3-二氨基联苯胺(DAB)，瑞士Fluke 公司产品。BH2 系统显微镜，日本Olympus 公
司产品。IMS 细胞图象分析系统，医学图象分析软件为上海申腾信息技术有限公司产品。摄
象机：Panasonic 公司产品，型号：MV-CP410。切片机，德国Lico 公司产品，产品型号：
RM2145。
1.4 实验方法
1.4.1 动物创面造模
糖尿病大鼠模型制造参照傅小兵等[1]方法改进，随机分为正常对照组，糖尿病对照组和糖尿
病实验（复黄膏）组，禁食24h 后(饮水不限)，分别在乙醚麻醉下尾静脉一次注射1.5%四氧
嘧啶(50mg/kg，实验组)及等体积生理盐水(对照组)，造模后4h 后给予5%葡萄糖水溶液饮用，
次日经尾部取血测血糖，血糖值大于10mmol/L 上，则表明造模成功。模型制成后，每3 天
测血糖一次，直到动物处死。创面造模：糖尿病大鼠模型制造完成后3 天，参照傅小兵等[2]
方法改进，wister 大鼠用1%盐酸氯胺酮（3ml/Kg）腹腔注射麻醉。局部备皮，常规消毒后，
于wister 大鼠背部取直径为3cm 左右圆形切口，剪开皮肤全层，至皮下筋膜，无菌敷料加
盖，每日换药一次。正常对照组造模同上。
1.4.2 用药
3 组于造模当日开始换药，换药前用1:5000 呋喃西林清洁创面。对照组外敷单层生理盐水纱
布；复黄膏组外敷单层复黄膏纱布。各组均外用两层消毒干纱布覆盖固定。每日换药1 次。
1.4.3 动物标本采集
用药后第3 天和11 天，将动物麻醉(氯胺酮)处死，用眼科手术剪分离新生创面肉芽组织，
并成块取下，为所需实验样品。
1.4.4 免疫组化检测方法
(1)EnVision 二步法测定：
取存档蜡块制成4μm 连续切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精至水。用0.01mol/L pH7.4 PBS
洗涤，3min×3 次。将切片移入水浴中（内含0.01mol/l Ph6.0 的CB 柠檬三钠缓冲液）放入
微波炉中用微波3 档（约98℃）加热20min 进行热诱导抗原修复，取出后在室温下自然冷
却，PBS 洗涤3min×3 次。在室温下，滴加0.3％H2O2 以抑制内源性过氧化物酶20min，PBS
- 3 -
洗涤3min×3 次。20%正常羊血清室温孵育30min，不洗。滴加一抗（分别为上述抗体及相
应抗体稀释度）在湿盒中37℃孵育120min 后，PBS 洗涤3min×3 次。滴加EnVision 反应液
（抗鼠，抗兔），50μl/片，37℃孵育30min。PBS 洗涤3min×3 次。0.05%DAB+0.03%H2O2
显色8min~12min。流水洗，苏木素衬染，热水蓝化。吹干后常规树脂封片。显微镜下观察：
背景呈紫蓝色，阳性产物呈棕黄色或黄色。对照设置：用PBS 代替一抗做阴性对照。
(2)免疫组织化学阳性着色的定量分析：
染色结果应用IMS 细胞图象分析系统医学图象分析软件在250 倍显微镜下，随机选取3
个视野，计算区域的阳性面积（um2），求出3 个视野平均值。
1.5 统计学方法
采用SPSS11.0 统计软件包对相关数据进行方差分析，P<0.05 具有统计学意义。
2. 结果
2.1 动物模型创面闭合指数
3组动物模型创面闭合指数变化，见表1。
表1 动物模型创面闭合指数。（%,X ±s）
注：#：与正常对照组比较，P<0.05；*：与糖尿病对照组比较，P<0.05。
2.2 复黄生肌愈创油膏对大鼠糖尿病创面中TGF-β1、samd3、samd7 水平影响
复黄生肌愈创油膏对Wister大鼠糖尿病创面3天TGF-β1,samd3、samd7水平影响，见表2。
表2 复黄生肌愈创油膏对大鼠糖尿病创面3天TGF-β1,samd3、samd7水平影响。(um2, X ±s) (n = 6)
注：#：与正常对照组比较，P<0.05；*：与糖尿病对照组比较，P<0.05。
复黄生肌愈创油膏对Wister 大鼠糖尿病创面11 天TGF-β1,samd3、samd7 水平影响，见
表3。
组别 3d 11d
正常对照组
糖尿病对照组
糖尿病实验组
3.10±1.53
0.78±0.57#
2.36±1.30*
77.55±10.00
42.39±9.78#
78.01±8.85*
组别 TGF-β1 samd3 samd7
正常对照组 33134.08±3021.38 13263.38±2168.40 25308.14±9190.61
糖尿病对照组 18617.89±10211.66# 8975.11±1936.41# 21038.97±12046.53
糖尿病实验组 30957.48±5524.13* 14269.0±3739.26* 22970.19±13268.12
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表3 复黄生肌愈创油膏对大鼠糖尿病创面11 天TGF-β1,samd3、samd7 水平影响。(um2, X ±s) (n = 6)
注：#：与正常对照组比较，P<0.05；*：与糖尿病对照组比较，P<0.05。
3. 讨论
复黄生肌愈创油膏是根据糖尿病溃疡“虚甚瘀重，瘀甚虚重”的病机立法，以祛瘀扶正,
方以大黄、蛋黄油为主药，一以活血祛瘀，一以扶正生肌；以紫草、血竭助大黄祛瘀止痛，
珍珠粉等助蛋黄油生肌收口，佐以龙骨收疮敛口，麻油生肌润肤。全方合用，有活血祛瘀、
生肌收口之功效，在临床促进难愈性创面愈合治疗上取得了一定的疗效[3]。本试验的动物模
型创面闭合指数结果显示，糖尿病实验组结果接近正常对照组的愈合指数，而明显优于糖尿
病对照组，同临床治疗结果相一致。
TGF-β是成纤维细胞的强效趋化因子，可以通过旁分泌和自分泌直接或间接、单独或协
同、同时或不同时相作用于炎症及修复细胞，产生细胞的趋化性迁移、增生分化，细胞外基
质合成及分泌三类重要的生物学效应。陈伟等【4】研究发现：机体内TGF-β的3种异构体的生
物学功能不尽相同, 与TGF-β2、β3 相比, TGF-β1 与伤口修复愈合的关系最为密切。创面修
复延迟的原因可能是由于溃疡处的TGF-β1因子含量下降, 而TGF-β2 和TGF-β3蛋白表达增
强, 引起肉芽生长缓慢, 血液供应不足, 基质纤维蛋白代谢失调等, 最终导致溃疡的发生【5】。
用药3天时，实验结果表明：糖尿病实验组TGF-β1含量明显高于糖尿病对照组（P<0.05），
但和正常对照组比较无统计学差异。表明复黄生肌愈创油膏在创面愈合早期具有促进糖尿病
难愈性创面中TGF-β1分泌的作用，从而促进创面愈合。
在已知的细胞因子中TGF-β被公认为是最重要的致纤维化细胞因子，是促进成纤维细胞
表型转换的重要因子。抑制TGF-β1的生物学作用可降低成纤维细胞增殖，有助于改善增生
性瘢痕的形成，对萎缩性瘢痕的治疗有一定的指导意义。用药11天时，实验结果表明：11
天时，糖尿病实验组TGF-β1含量明显低于正常对照组（P<0.05），但和糖尿病对照组比较无
统计学差异。提示复黄生肌愈创油膏在创面愈合后期具有抑制糖尿病难愈性创面中TGF-β1
分泌的作用，从而降低纤维细胞过度增殖，减少瘢痕形成。
Smads蛋白是TGF-β家族信号从受体到胞核的细胞内转导分子。TGF-β与其受体TβR I结
合后激活TβR II受体，磷酸化Smad2、Smad3蛋白，磷酸化的Smad2、Smad3才能与Smad4 形
成活性的转录复合物进入核内，调节相应靶基因转录，进而调节创面愈合。smad7是细胞内
I型受体的拮抗蛋白，能与活化的TβR I牢固结合,阻止Smads的磷酸化，从而自动反馈调节
TGF-β对靶基因的转录【6】。用药3天时，实验结果表明：糖尿病实验组smad3含量明显高于糖
尿病对照组（P<0.05），但和正常对照组比较无统计学差异；smad7含量三组比较无统计学差
异，提示在创面愈合早期复黄生肌愈创油膏通过增加TGF-β/smad信号转导通路中TGF-β1及
smad3表达发挥促进创面生长作用，而此时抑制型smad蛋白——smad7还未启动负反馈抑制
作用，也有利于创面愈合。用药11天时，实验结果表明：糖尿病实验组smad3含量明显低于
正常对照组（P<0.05），但和糖尿病对照组比较无统计学差异；糖尿病实验组smad7含量明显
高于正常对照组和糖尿病对照组（P<0.05）。陈伟等【7】研究中亦发现增生瘢痕组织中TGF-β1，
组别 TGF-β1 samd3 samd7
正常对照组 40015.53±3956.50 19544.11±12485.10 8028.11±1187.25
糖尿病对照组 23154.13±14499.62# 10427.19±1533.11# 9189.73±4647.89
糖尿病实验组 23869.93±11094.0# 10063.0±1754.40# 17598.96±9561.0#*
- 5 -
Smad2和Smad3基因表达量显著高于正常皮肤组织，胎儿皮肤组织中TGF-β1，Smad3基因表
达量显著低于正常皮肤组织。TGF-β1，Smad3基因在胎儿皮肤组织细胞内低表达可能是皮肤
伤口无瘢痕愈合的重要机制。虞海燕等【8】利用定量PCR技术检测瘢痕疙瘩，发现抑制型
Smad(Smad6、Smad7)mRNA的表达在瘢痕疙瘩的皮肤组织中均非常显著地低于正常瘢痕
(P<O.01或P<O.05)及正常皮肤组织(P<0.01或P<O.001)。此结果表明的抑制型Smads(Smad6和
Smad7)mRNA在瘢痕疙瘩组织中的低表达可能是瘢痕疙瘩组织中增高的TGF-β信号转导不
能被自身的负反馈循环终止的原因之一，从而导致瘢痕疙瘩中成纤维细胞过度增殖和胶原的
过度沉积。我们的实验结果提示，在创面修复后期复黄生肌愈创油膏可能通过抑制TGF-β1，
Smad3的表达，同时增加抑制型Smad转导信号Smad7的表达，达到抑制TGF-β的病理性作用，
使成纤维细胞增殖受阻而发挥抑制瘢痕形成的作用。
综上，复黄生肌愈创油膏在糖尿病溃疡创面愈合过程中参与调节smad3/samd7不同时段
的表达，影响TGF-β1的分泌，从而起到促进创面愈合的作用，同时可一定程度上减少瘢痕
形成。
参考文献
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Dynamic effects of“Compound Rhubarb
Granulation-Promoting and Wound-Healing Ointment”on
the expression of TGF-β1,samd3,samd7 of granulation tissue
of Wister rat diabetic wound Healing
Tang Hanjun1, Wang Zhenyi2, Xiao Xiuli1, Liu Xiaodong1, Yin Jianyun1, Cai Huiqun1,
Shen Liang1,
1.Longhua Hospital ,Shanghai University of TCM, Shanghai (200032)
2. Yueyang Hospital of Integrated TCM and Western Medicine, Shanghai University of TCM,
Shanghai (200437)
Abstract
Objective:To explorer dynamic effects of“Compound Rhubarb Granulation-Promoting and
Wound-Healing Ointment”(CRGWO) on the expression of TGF-β1,samd3,samd7 of granulation tissue
of Wister rat diabetic wound Healing. Methods: Thirty-six male Wister rats were randomized into 3
groups:diabetic trial (CRGWO) group, normal control group, diabetic control group. The expression of
TGF-β1,samd3,samd7 of granulation tissue of Wister rat diabetic wound were detected by
- 6 -
immunohistochemical method in day 3 and day 11. Results: On the third day of wound healing, the
expression of TGF-β1 and smad3 in diabetic trial group were higher than that of diabetic control group
(P<0.05), but compare to the normal control group without statistical difference; the expression of
smad7 in three groups have not statistical difference. On the eleventh day of wound healing, the
expression of TGF-β1 and smad3 in diabetic trial group were lower than those of normal control group
(P<0.05),but compare to the diabetic control group have not statistical difference; the expression of
smad7 in diabetic trial group were higher than those of the others groups (P<0.05).Conclusion:The
expression of TGF-β1 and smad3 in diabetic trial group were ascending in the early phase of wound
healing which shows the CRGWO can promote wound healing via spurring the expression of certain
cytokines and their signal transduction; in the late phase of wound healing, the expression of TGF-β1
and smad3 in diabetic trail group were descending, as well as the expression of Smad7, –the inhibitor
of Smads in cell signal transduction, were ascending, which means CRGWO may open the inverse
signal feedback of wound healing, thus prevent the scars formation by stopping the excessive cells
proliferating.
Keywords: Compound Rhubarb Granulation-Promoting and Wound-Healing Ointment, wound healing,
TGF-β1, samd3,samd7
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